Archivo Médico de Camagüey 2005; 9(1) ISSN 1025-0255
Instituto Superior de Ciencias
Médicas”Carlos J. Finlay”. Camagüey.
DISEÑO Y
VALIDACIÓN DE UN SISTEMA INMUNOENZIMÁTICO ELISA PARA CUANTIFICAR LIPOPROTEÍNA
(a) EN SUERO HUMANO
Dra. Aidelian Jevey González*; Dr.
Andrés Pedrosa Amado**; Dr. Ángel Nápoles Vega***; Dra. Silvia Hernández
González***; Dr. Roger Ramírez Zayas****
* Especialista
de I Grado en Bioquímica Clínica. Profesor Instructor. Facultad de Ciencias
Médicas. Las Tunas.
** Especialista de II Grado en
Bioquímica Clínica. Profesor Asistente.
*** Especialista de I Grado en Bioquímica
Clínica. Profesor Asistente.
**** Especialista de II Grado en Bioquímica Clínica. Profesor Titular.
RESUMEN
La lipoproteína (a) es considerada un factor de
riesgo cardiovascular. Elevadas concentraciones en sangre de esta lipoproteína
están asociadas con un incremento de la incidencia y severidad de la
ateroesclerosis. La evaluación del riesgo cardiovascular relacionada con la Lp(a) se realiza sobre la base de las concentraciones
plasmáticas de dicha lipoproteína. Las concentraciones séricas de esta
lipoproteína se miden a través de diferentes métodos, pero los ensayos inmunoenzimáticos ELISA son los de mayor aplicación en esta
finalidad. En nuestra investigación se describe el diseño y la validación de un
sistema ELISA indirecto tipo sándwich que utiliza anticuerpos poligonales anti-Lp(a) humana. La validación
del sistema se realizó según los parámetros propuestos por el Europeun Committee for Clinical Laboratory
Standard y se aplicaron los siguientes parámetros: curva de calibración,
imprecisión (within-rum y between-rum), sensibilidad,
especificidad y determinación de Lp(a) en suero de
pacientes.
DeCS: DISEÑO DE DROGAS; TEST DE ELISA;
LIPOPROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN
El índice actual de morbilidad y mortalidad por
enfermedad de la arteria coronaria, la enfermedad cerebrovascular y la
enfermedad vascular periférica ha aumentado en la población mundial. Estas
enfermedades están relacionadas con el desarrollo de la ateroesclerosis,
afección multifactorial de causa no precisada, pero de la que se conocen
actualmente algunos factores de riesgo, cuyo control pude detener la progresión de la misma.1
La Lp(a), una partícula
similar a la lipoproteína de baja densidad (LDL), es considerada como un factor
mayor e independiente de riesgo cardiovascular2 y de ateroesclerosis
preclínica3 Elevadas concentraciones en sangre de esta lipoproteína
están asociadas con un incremento de la incidencia y severidad de la
ateroesclerosis.4,5
La evaluación del riesgo cardiovascular asociado
con la Lp(a) se realiza sobre la base de las
concentraciones plasmáticas de dicha lipoproteína.6
Se han medido las concentraciones de Lp(a) en suero o plasma mediante inmunodifusión
radial, electroinmunoensayo, inmunoelectroforesis,
radioinmunoensayo y ensayo inmunoenzimático.7,8 Dentro de éstos, los ensayos inmunoenzimáticos
en fase sólida, ELISA HGhg tienen una gran aplicación debido a su alta
sensibilidad y especificidad.9,10
En nuestra investigación se describe el diseño de
un sistema ELISA indirecto tipo sandwich que utiliza
anticuerpos policlonales anti-Lp(a) humana.
MÉTODO
En este sistema, la retención de enzimas presentes
en el conjugado es proporcional a la cantidad de elementos a determinar
inmovilizados por el anticuerpo captura; constituye la base teórica del sistema ELISA diseñado.11
La validación del sistema se realiza según los
parámetros propuestos por European Committee for Clinical Laboratory
Standard.12 . En el nuestro se aplicaron:
- Curva de
calibración, confeccionada con las concentraciones conocidas de los
controles positivos.
- Imprecisión, la
cual implica el comportamiento de la precisión del sistema intraplaca (within-rum) e interplaca (between-rum).
- Sensibilidad, se
define como la concentración de Lp(a) que se
corresponde con la absorbancia de los blancos, más dos desviaciones
estándar.
- Especificidad, se
ensayan las posibles reacciones cruzadas contra metabolitos séricos.
- Determinación de Lp(a) en suero de pacientes.
- DISEÑO DEL SISTEMA ELISA
Se diseña un ELISA-HADAS no competitivo de tipo
sándwich que utiliza doble anticuerpo heterólogo.
Consta de ocho fases: fase I de sensibilización, fase sólida en placa de microtitulación de cloruro de polivinilo y el anticuerpo de
captura una IgG policlonal
de carnero anti-Lp(a)
humana; la fase II de bloqueo con PBS1X/Tween 200.05
% / 200mg leche descremada; la fase III de muestras y controles con suero
humano; C Reference Standart
Human Lp(a) y C+ BSA(BDH. England); La fase IV del
segundo anticuerpo con IgG policlonal
de conejo anti-Lp(a)
humana. (Laboratorio de Inmunología y Biológicos); La fase V de conjugado con IgG de carnero anti-IgG de conejo conjugada con peroxidasa
1:3000; la Fse VI del sustrato con OPD; la Fase VII
de detener la reacción con ácido sulfúrico 2N y la fase de lectura de la placa en Labsysterms
Multiskaan Plus a 492nm. Al
final de cada fase, hasta la V se realiza un lavado con PBS 1X/Tween 20 0.05 %
I.
ESTANDARIZACIÓN DEL SISTEMA
1.
Sensibilización:
se ensayan concentraciones de anticuerpos captura (recubrimiento) entre 1 y 10 mg/mL. Se incuba en cámara húmeda durante toda la
noche a 4oC.
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1 |
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B |
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C |
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D |
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E |
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H |
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2.
Bloqueo:
leche descremada al 0.05 % en Buffer Bicarbonato pH:
9.6. Una hora a 37oC.
3.
Antígeno: se
aplican cuatro muestras duplicadas a concentraciones conocidas del antígeno
utilizado. (Reference Standart Human Lp(a) 67 mg/dl.
C + - 4.18 mg/L
C + - 8.37 mg/L
C + - 16.17 mg/L
C + - 33.5 mg/L
C- - Albúmina
sérica bovina (BSA) (BDH. England) a una concentración de 33.5 mg/L.
Blanco: control del conjugado, no se pone ni
antígeno ni segundo anticuerpo, en su
lugar se ponen 100 mL de diluente.
Control segundo anticuerpo: no se pone el Ag, en su lugar se ponen 100 mL de diluente.
4.
Segundo
anticuerpo: IgG de conejo anti-Lp(a) humana. En diluciones de 1:1000, 1:2000, 1:3000 para
cada recubrimiento.
5.
Conjugado: IgG de carnero Anti-IgG de conejo conjugada con Peroxidasa.
Dilución de trabajo 1:3000 (CIGB-Camagüey).
6.
Solución de
lavado y diluente: PBS 1X / Tween-20 0.05%.
II.
VALIDACIÓN
DEL SISTEMA
Se tienen en cuenta los parámetros propuestos por
el European Committee for Clinical Laboratory
Standard.11
Los parámetros a observar en este sistema son:
1.
Curva de
calibración. Para su confección se utilizan las concentraciones de los
controles positivos.
2.
Imprecisión.
Se utilizan tres muestras con concentraciones dentro del rango analítico.
Precisión intraplaca. (Within-rum): se ensayan doce
veces, por duplicado, cada una de las muestras en una misma placa de microtitulación. Se calcula la media, la desviación
estándar y el coeficiente de variación (CV).
Precisión interplaca. (Between-rum): el ensayo se
realiza con dos muestras, por duplicado, en nueve placas diferentes. Se calcula
la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación. (CV).12
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INTERPRETACIÓN
DE LOS RESULTADOS |
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Within-rum (CV) |
Between-rum (CV) |
score |
Evaluación |
|
> 10 % |
> 20 % |
0 |
Inadecuado |
|
5 - 10 % |
10 - 20 % |
1 |
Aceptable |
|
< 5 % |
< 10 % |
2 |
Muy aceptable |
3.
Sensibilidad:
para determinar el límite de detección se ensaya el reactivo blanco (diluente)
en número de cuarenta veces, por duplicado en una placa. Se calcula la media y
la desviación estándar. El valor de detección límite es la media mas dos veces
la desviación estándar (M + 2 x SD).
4.
Especificidad:
se descarta las posibles reacciones cruzadas, utilizando metabolitos presentes
en suero humano. Los ensayos se realizan contra albúmina sérica, hemoglobina, y
el pigmento bilirrubina. Estos metabolitos sustituyen al antígeno en el ensayo.
Los sueros utilizados se aplican a la placa en diluciones de 1:25, 1:50, 1:100.
5.
Determinación
en suero de pacientes: se utiliza suero de pacientes convalecientes de infarto
agudo del Miocardio. Se utilizan diluciones para cada muestra de 1:25, 1:50 y
1:100. Las muestras se conservan a -70 oC hasta el momento de su
utilización.
6.
Aspectos
subjetivos. Se tiene en cuenta:
Precisión del operador.
Claridad de los protocolos de trabajo.
Calidad de los reactivos y materiales utilizados.
Equipos calibrados y declarados aptos para el uso (CEN)
III.
PROCESAMIENTO DE LOS DATOS
Los datos se procesaron mediante el equipo Labsystems Multiskan Plus, que incluye tarjetas para el procesamiento estadístico. Otros análisis
estadísticos se realizaron mediante el Microsoft Exel.
Se diseñó un sistema ELISA tipo sándwich no
competitivo.
La fase sólida utilizada fue la placa de microtitulación
de cloruro de polivinilo.
La concentración óptima de IgG
de carnero en el recubrimiento fue de 2.8 mg / mL
Las condiciones de
incubación para esta fase en cámara húmeda, a 4oC durante
toda la noche.
Para el bloqueo resultó adecuada la utilización de
leche descremada al 0.05 %
El antígeno utilizado como control positivo se
diluyó en orden descendente con PBS 1X. Se incubó 1h a temperatura ambiente y
con agitación mecánica.
El segundo anticuerpo (IgG
de conejo anti-Lp(a)
humana) se utilizó a una dilución de 1:2000 por ser la dilución en la que
mostró menor reacción inespecífica. Las condiciones de incubación son las
mismas que la fase anterior.
El conjugado se utilizó a la dilución de trabajo
que recomienda el productor. (1:3000) y las condiciones de trabajo son iguales
a la fase anterior. Luego de 30 min. incubando el
sustrato (OPD) a temperatura ambiente y protegido de la luz, se detiene la
reacción con ácido sulfúrico 2N.
Se hace la lectura a 492 nm
en el Labsystems Multiskan Plus.
Los lavados se realizaron entre cada fase con PBS
1X/Tween-20 0.05 % como agente tensoactivo.
Evaluación
de sistema
Se construyó curva de calibración.
Los valores de la evaluación de la precisión intraplaca se localizaron entre el 5 y el 10 %.
Los valores de la evaluación de la precisión interplaca se localizaron entre el 10 y el 20 %.
El límite de detección del sistema fue fijado en
2.79 mg/l.
Se determinó que el sistema era específico.
Se realizaron determinaciones en suero de
pacientes.
La curva de calibración se construyó utilizando
los controles positivos.
Los resultados de la evaluación de la precisión intraplaca (within-rum)
RESULTADOS
Los valores del CV se localizaron entre el 5 % y
10 %. Según el European Committee
for Clinical Laboratory Standard (ECCLS) estos valores están dentro del
rango aceptable (Tabla 1).
Tabla 1.
Precisión intraplaca (within-rum)
|
Muestra |
Media ± DS. Lp(a) mg/l |
CV (%) |
|
1 |
5.79 ± 1.30 |
6.37 |
|
2 |
19.36 ± 0.61 |
3.15 |
|
3 |
26.07 ± 2.13 |
8.19 |
Con respecto a la evaluación de la precisión interplaca (between-rum),el coeficiente de variación
(CV) en las nueve placas analizadas para las dos muestras osciló entre 10 % y
20 %, estos valores están dentro del rango aceptable (Tabla 2).
Tabla 2.
Precisión interplaca (between-rum)
|
Muestra |
Media ± DS. Lp(a) mg/l |
CV(%) |
|
1 |
9.06 ± 1.30 |
14.34 |
|
2 |
34.06 ± 5.6 |
16.29 |
La sensibilidad del sistema se determinó por
ensayo repetitivo (n=40) del reactivo blanco. El
límite de detección del sistema fue fijado en 2.79 mg/l
(media ± 2 X SD)
La especificidad del sistema se determinó
descartando reacciones cruzadas con metabolitos séricos, las lecturas
estuvieron por debajo del valor límite del sistema (Tabla 3).
Tabla 3.
Reacciones cruzadas
|
Hb |
1.07 mg/L |
|
Albúmina |
1.04 mg/L |
|
Bilirrubina |
0.92 mg/L |
Las muestras de los resultados de la lectura
realizada a sueros de pacientes se ensayaron diluidas 1:25, 1:50 y 1:100.
Tabla 4.
Muestras de pacientes
|
Paciente |
Concentración
Lp(A) en suero |
|
1 |
871.55 mg/L |
|
2 |
413.85 mg/L |
DISCUSIÓN
El sistema ELISA tipo sándwich, no competitivo,
utiliza fijado a la fase sólida como anticuerpo captura un anticuerpo policlonal de carnero anti-Lp(a) humana. El
segundo anticuerpo es una IgG de conejo anti-Lp(a) humana, obtenida y purificada
en el Centro de Inmunología y Biológicos del ISCM-Camagüey. El diseño incluye
una IgG de carnero anti-IgG de conejo conjugada con peroxidasa.
ESTANDARIZACIÓN
DEL SISTEMA
La fase sólida utilizada (placa de microtitulación de cloruro de polivinilo) en ocasiones
muestra una fuerte coloración de fondo, pero son recomendadas cuando se utiliza
en esta fase de sensibilización inmunoglobulinas, al ser el fenómeno de desabsorción menos frecuente.10
La concentración óptima de IgG
de carnero en el recubrimiento fue de 2.8 mg / mL. Esta selección se hace en base a los resultados
que permiten una mayor diferenciación entre los controles positivos más débiles
y los controles negativos.10, 11Las condiciones de incubación para
esta fase en cámara húmeda, se realiza durante toda la noche a 4oC.11,12
CONCLUSIONES
1. Se diseñó un sistema ELISA indirecto que utiliza
doble anticuerpo heterólogo que cuantifica Lp(a) en suero humano.
2. El sistema propuesto cumple con los parámetros de
evaluación que exige el ECCLS como son imprecisión (precisión interplaca y precisión intraplacas),
sensibilidad y especificidad.
3. El sistema diseñado es de utilidad en la
cuantificación sérica de Lp(a) en suero de pacientes.
ABSTRACT
Lipoprotein (a) is considered a
cardiovascular risk factor. High blood concentrations of this lipoprotein are
associated with an increased incidence and severety
of atherosclerosis. Assessment of the cardiovascular risk associated with Lp(a) is
carried out on the bases of plasmatic concentrations of the said lipoprotein.
Serum concentrations of this lipoprotein has been measured by different methods, but inmunoenzymatic essays ELISA have had more application in
this respect. In this work, design and validation of an indirect, sandwich type
ELISA system validation was performed according to the proposed parameters by
the European Committee for Clinical laboratory Standard. Among these
parameters, the following are applied to our system: calibration curve, unpreciseness (within rum and between rum) determination of
Lp(a)
in the serum of patients.
DeCS: DRUG DESIGN; ENSYME–LINKED
INMUNOSORBENT ASSAY; LIPOPROTEINS
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Recibido: 16 de junio de 2003.
Aceptado: 18 de enero de 2004.